功能基因组学研究的一个重要方面是植物转录因子。转录因子(transcription factor)是一群能与基因5`端上有特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。在植物特异蛋白中，转录因子就占到了13%。研究已经证明一类植物特有的转录因子-GRAS家族基因在植物生长发育以及细胞代谢方面都具有重要的作用，如：分生组织的形成、雄配子发育、赤霉素信号转导、光敏色素信号转导等。例如SCL13是一种参与光敏色素B(phyB)信号转导的蛋白质分子，它在脱黄化过程中，起拉长胚轴的作用 (Torres-Galea et al., 2006)，在水稻分蘖时期MOC1蛋白是控制其分蘖的关键因子，它的发现为人们更好的理解水稻分蘖分子调控机理奠定基础，也为提高水稻产量方面提供了一个重要依据 (Li et al., 2003)。 目前在拟南芥基因组中已经鉴定了33 个GRAS 家族基因，并发掘出其在植物生长发育过程中所起的作用和在组织中的特异性表达。(Lee et al., 2008) microRNA171调控GRAS家族中的一些基因的表达，比如控制拟南芥花和根系的发育是通过miR171调节具有GRAS功能域转录因子家族基因(如SCL6-Ⅱ、SCL6-Ⅲ和SCL6-Ⅳ)来实现的 (孙欣等，2011)。但是由于GRAS家族成员较多，而目前已经进行功能分析的GRAS基因又很有限，为了能更加深入理解GRAS家族基因在植物生长发育和基础代谢等过程中的作用就需要我们对更多的成员进行克隆和研究。

 

枳即“枸橘”，橘生淮南则就橘，生于淮北则就枳。它是绝大多数柑橘品种的一种优良的砧木，也是研究柑橘的重要材料，其中在柑橘分子生物学，柑橘基因组学， 柑橘 EST测序，柑橘基因功能分析等方面作为重要的试验材料(Cristofani-Yaly et al., 2007)。在枳上进行转录因子的研究以及GRAS家族基因功能的分析，对于利用该基因达到调控其花器官发育、转变其童期以及提高其砧木育种效率等生长发育过程都有着重要的理论价值。

 

基因表达产物在植物组织中的亚细胞定位是功能基因组学研究的重要内容之一。基因亚细胞定位研究是为了研究者们对植物生长发育、形态建成以及抗逆性等方面有更系统的理解，也为蛋白质功能分析，蛋白质生物学功能推断提供重要信息。(周善跃, 2009)目前，应用较普遍的植物蛋白的亚细胞定位方法是报告基因定位法即借助于报告基因表达产物的特性来实现目标蛋白的定位，近年来被应用于蛋白质定位研究较多的是绿色荧光蛋白(GFP)(夏平安等, 2004)。

 

本文作者通过对枳cDNA文库的筛选，利用RACE技术获得了枳GRAS类转录因子SCL6和GRAS的全长，利用生物信息学对其序列进行了分析，为进一步了解SCL6和GRAS的分子生物学功能，本研究首先通过亚细胞定位实验，验证SCL6和GRAS是否具有核定位功能。

 

1结果与分析

1.1 Pt-SPL6和Pt-GRAS cDNA全长及其推导的氨基酸序列

作者是把枳幼叶和花器官的cDNA作为模板，分别与根据柑橘SCL6和GRAS的cDNA全长设计的特异引物P03/P09和P06/P12进行3’ RACE和5’RACE扩增，随后经过克隆测序分别得到Pt-SCL6和Pt-GRAS基因的3'末端(1,960 bp和1,500 bp)和5'末端(900 bp和600 bp)。还是以前面的cDNA为模板，引物为P07/P08和P13/P14，进行PCR克隆获得全长分别为2,1188 bp和1,908bp的ORF。然后将3’端、5’端和ORF拼接分别获得枳全长为2 668 bp和1 911 bp的 SCL6和GRAS cDNA，分别有一个2,118 bp和1,908 bp完整的开放阅读框(ORF)，353 bp和132 bp的5'非翻译区(5'UTR)，194 bp和2400 bp的3'非翻译区(3'UTR)以及26 bp和27 bp的poly+(A)尾。该cDNA分别推导编码706个和509个氨基酸分别包含有枳miR171和miR1446的识别位点(图1)。通过TMHMM2.0和SignalP3.0软件分析，发现Pt-SCL6和Pt-GRAS蛋白不含有跨膜区和信号肽。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi网站进行蛋白质结构功能域分析，发现该蛋白序列的分别从第347-705和第136-508区域含有GRAS结构域(图1A和B)，属于GRAS转录因子家族中的保守结构域。

 

 

 

1.2 PSIPRED在线程序预测的Pt-SCL6和Pt-GRAS基因编码蛋白的二级结构

用PSIPRED在线程序预测的Pt-SCL6和Pt-GRAS基因编码蛋白的二级结构如图4所示。图中显示Pt-SCL6和Pt-GRAS成熟蛋白的二级结构中都包含ɑ-螺旋、β-折叠和随机卷曲结构，再用SOPMA程序进一步分析得知，这三种结构在Pt-SCL6占32.44 %、13.88 %、和53.68%，而在Pt-GRAS蛋白中分别48.92 %、11.59 %、和39.49 %，由此Pt-SCL6和Pt-GRAS蛋白结构分别主要由随机卷曲和ɑ-螺旋组成，并都属于混合型蛋白。

 

1.3 BAP和NAA对芽再生的影响

用Hind Ⅲ和XbaⅠ对表达载体pJIT166-GFP和3.2中Pt-SCL6和Pt-GRAS的ORF正确的克隆提取质粒同时进行双酶切，再已经酶切过的表达载体pJIT166-GFP与目的片断在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到35S-GW-GQ505957-GFP和35S-GW-GU072592-GFP融合表达载体，然后将其转入到热击转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞中，进行PCR、酶切从而筛选出所需要的阳性克隆，并进行测序验证分析。

 

通过构建绿色荧光蛋白基因与Pt-SCL6和Pt-GRAS两个基因 ORF的瞬时表达载体，并将其转化到洋葱表皮细胞中，获得高效瞬时表达，从而通过绿色荧光蛋白的荧光信号来确定目标蛋白在细胞内的位置，用该方法以达到确定基因表达产物-蛋白质在细胞中发挥功能的具体部位目的。如图3-A-d和3-B-d所示，在细胞核内和细胞质中都可以观察到GFP的绿色荧光信号是由于对照的GFP蛋白没有细胞核定位的功能，可以通过核孔扩散到细胞核内，又如图3-A-c和3-B-c所示，仅在细胞膜产生绿色荧光，可见转录因子Pt-SCL6和Pt-GRAS表现出在细胞膜区域定位的现象。这一事实表明Pt-SCL6和Pt-GRAS均不具有核定位功能。

 

2讨论

目前，人类对生物代谢及生命过程的研究已经进入了基因水平的阶段，有关功能基因的研究也成为了一个热点。进行功能基因的研究首先需要将其克隆出来，为其后续研究提供一个基础；其次要进行蛋白质的亚细胞定位，因为在生物的生命活动中起直接作用的是基因的表达产物-蛋白质，而蛋白质的功能与其在细胞中的位置密切相关。因此，对基因进行克隆和对其表达产物进行亚细胞定位是研究功能基因的两个重要环节。

 

 

 

 

 

一般情况下，克隆未知基因行需要进行保守结构域的比对，兼并引物的设计3’ 端和5’ 端序列的扩增等一系列实验过程。本实验过程中作者对枳中未知的GRAS基因进行了电子克隆。通过同源序列的比对和分析后，得到目的基因序列，并对目的序列的正确性进行了验证。结果表明，该基因克隆方法是一种快速简便的方法，既简化了步骤又增加了目的序列的正确性。这种方法适用于已经建立了EST库的物种上。

 

GRAS结构域是高等植物所特有的一类转录因子，拟南芥中miR171 通过对具有GRAS 结构域的SCL(SCARECROE-LIKE)转录因子家族成员如SCL6-II、SCL6-III 和SCL6-IV的调控，来控制花的发育和根系发育(Llave at al., 2002)。本研究通过构建枳的cDNA 文库中克隆到两个GRAS基因全长即Pt-SCL6和Pt-GRAS其编码的蛋白都有GRAS结构域，属于GRAS转录因子家族中的保守结构域，为了进一步确定相关F-box基因蛋白在细胞中的存在位置，本试验首次以枳为试材，通过GFP标记方法研究了Pt-SCL6和Pt-GRAS基因的亚细胞定位特性。研究结果表明，Pt-SCL6和Pt-GRAS均定位于细胞膜中。转录因子Pt-SCL6和Pt-GRAS表现出在细胞膜区域定位的现象，不具有核定位功能。

 

3材料与方法

3.1电子克隆

为了在柑橘中获得EST序列，作者首先在GenBank的核酸数据库中对拟南芥的SCL6基因序列NP_191926和杨树GRAS基因序列XM_002322191进行检索,由于不同物种间同源基因的核酸序列具有相对保守的特点，所以可以把已检索出的拟南芥NP_191926(SCL6)和杨树XM_002322191(GRAS)作为探针， BLAST 检索柑橘EST数据库，结果分别得到了具有高度相似性的EST序列EY745185和DY287666，接着再BLAST检索该两个高相似序列，将检出与EY745185和DY287666序列有部分重叠或同源性较高的的EST序列(EY747196，EY693961，EY697821，CX078582)和(DY268860，FC901464，FC897031)拼接组装为克隆重叠群，重复以上过程，反复的拼接和比对EST重叠群序列，从而尽可能的获得枳SCL6和GRAS的cDNA全长(张波等, 2008；宋长年等, 2009)。

 

3.2实验克隆

3.2.1试验材料

供试材料来自于江苏省太湖常绿果树技术推广中心—苏州科学研究所的枳(P. trifoliata)采其幼叶和花后立即用液氮冷冻，并带回实验室于-70 ℃保存，为提取其总RNA备用。

 

3.2.2菌株、质粒以及实验试剂亚细胞定位载体，大肠杆菌菌株DH5

 

 

3.2.3提取和纯化枳的RNA

枳的叶和花组织中总RNA的提取是采用CTAB法并用DNaseⅠ酶进行消化出去DNA。然后用的PloyATtract® mRNA Isolation System IV试剂盒(Promega公司生产)进行mRNA的纯化。

 

3.2.4反转录合成cDNA

利用mRNA模板和反转录引物经过PCR反转录合成对应的cDNA，再进行一系列的保温、冰浴冷却后，置于-70 ℃冰箱中保存备用。其中模板是3.2.3提取并纯化后的mRNA，合成cDNA第一条链的反转录引物是P01，延伸加帽子的引物是P02。

 

3.2.5 PCR对基因3’和5’末端进行扩增

把上一步反转录合成的cDNA作为模板，分别以引物P03/P04和引物P09/P10为PCR扩增引物进行扩增获得目的基因Pt-SCL6和Pt-GRAS的3’末端。其中所采用的反应体系和反应参数参照宋长年等(2009)电子克隆方法中的50μL的反应体系和35个循环的反应参数。之后用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测并割胶回收目标片段(利用Axygen公司生产的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)，将回收的目标片段与pMD18-T Simple克隆载体连接，进行T/A克隆，将菌液交于公司进行测序。用同样的方法以引物P05/P06和P11/P12为扩增引物进行PCR扩增以得到基因Pt-SCL6和Pt-GRAS的5’末端。

 

3.2.6扩增基因的ORF

以引物P07/P08 和P13/P14为扩增引物，用3.2.4反转录合成的cDNA作为模板，进行PCR扩增获得Pt-SCL6和Pt-GRAS的ORF。反应体系和反应参数及回收、克隆与测序都同上，唯一不同的是反应体系中的Taq酶用的是Ex-Taq酶。

 

3.2.7生物信息学分析

将以上扩增出的SCL6和GRAS的ORF、3’末端和5’末端等序列利用DNAMAN5.22软件进行拼接分析；分别用BLASTn和BLASTp对该序列的核苷酸和氨基酸序列进行相似性分析；用PSIPRED在线程序预测的Pt-SCL6和Pt-GRAS基因编码蛋白的二级结构(Liam et al., 2000)。

 

3.3亚细胞定位载体的构建

用内切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ同时双酶切上面测序正确的Pt-SCL6、Pt-GRAS的ORF提取质粒和载体pJIT166-GFP，电泳检测后，分别回收目的基因片段和空载体；经T4 DNA连接酶连接从而得到35S-GW- GQ505957/ GU072592--GFP融合表达载体，然后将其分别转入到热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行PCR检测、酶切检测、测序等一系列过程筛选并验证阳性克隆及其正确性。

 

3.4 35S-GW-GQ505957/ GU072592-GFP转化洋葱表皮细胞

3.4.1 制备微粒子弹

方法是DNA的钨粉包埋法 (徐淑平等, 1998)。具体操作：取50 mg/mL钨粉悬液和2.5mol/LCaCl2各50 μL， 0.1 mol/L亚精胺20 μL，以及35S-GW- GQ505957/ GU072592-GFP载体质粒5 μg充分混匀，经离心、冰浴静置后用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次后沉淀，50 μL纯酒精悬浮沉淀。

 

3.4.2基因枪轰击受体材料

本实验的受体材料是幼嫩的洋葱表皮，将其经过MS高渗预培养后切成约1 cm ×1 cm 的小块放在10 g/L琼脂培养基上，同时将20 μl钨粉DNA混合物点在轰击膜中央，采用基因枪进行轰击，轰击后将其细胞暗培养后制片，通过激光共聚焦显微镜观察细胞中的荧光。用20％蔗糖溶液对转化了的洋葱表皮进行处理使其质壁分离，再用紫外光和蓝光激发成像并拍照(杨光等, 2011)。

 

作者贡献

李阿英完成了主要实验操作和文章初稿的写作；刘洪在 GRAS家族蛋白序列的相关软件的使用等实验操作中提供指导和帮助；宋长年是项目的构思者及负责人，提供写作思路与最后审阅和修改工作 ；李晓颖和郭磊，对论文进行了详细的阅读和并提出修改意见。在这里对他们致以诚挚的感谢!

 

致谢

诚挚感谢教育部科学技术研究重点项目(109084)；江苏省2009年度高校研究生科研创新计划(CX09B_238Z)。

 

参考文献

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